신경영상을 개선한 차세대 조직확장법
신경세포 연결을 형성하는 단백질과 같은 구조가 현미경으로는 해결할 수 없을 정도로 작을 때 교묘한 화학 작용으로 모든 것을 더 크고 쉽게 볼 수 있다는 것이 조직확장 기술의 영광이다.
그러나 때때로 화학적 결합은 형광 항체 라벨을 단백질에 부착하여 그것들을 볼 수 있도록 해야 하는 바로 그 곳에서 형성된다.
이제 MIT 연구팀이 표준 콘포칼로컬 현미경으로 신경 연결 구조를 영상화하는 데 있어 엄청난 향상을 보여주면서 이 문제를 해결했다.
이번 업그레이드는 정광훈 부교수 연구실이 2016년 도입한 ‘프로테오메 확대분석’ 기술인 ‘eMAP’에서 새롭고 개선된 버전으로 구현된다.
‘e’는 형광 항체 라벨의 결합 부위가 차단될 가능성이 훨씬 낮다는 뜻으로, 비문 보존을 의미한다.
최근 사이언스 어드밴스지에 실린 논문에서 정 교수와 공동 저자는 eMAP를 통해 이전에는 할 수 없었던 신경 연결에 있는 많은 단백질, 즉 ‘시냅스’가 이제는 이미징될 수 있다는 것을 보여준다.
“eMAP는 시냅스의 미세한 분자 구조를 보존하고 있으며, 기성 항체의 대형 도서관과의 탁월한 호환성으로 고분자 조립체의 고투과 분석을 용이하게 할 수 있다”고 주 저자인 조하 박, 사림 칸, 대희윤을 포함한 과학자들은 보고한다.
이들은 Picower Institute for Learning and Memory, 의학 공학 및 과학 연구소, MIT의 화학 공학 및 뇌와 인지 과학(BCS) 부서에 걸쳐 있는 그의 연구실에서 정 교수와 함께 일하고 있다.
노출상피
조직 팽창 기술은 아크릴아미드 메시를 조직에 주입하여 모든 단백질을 고정시켜 메쉬가 팽창할 때 모두 함께 팽창하지만 서로 상대적으로 같은 위치에 머무르게 하는 방식으로 작용한다.
이 기술은 일반적으로 고정제 포름알데히드의 화학적 결합으로 고정하는 것을 달성한다.
eMAP를 통한 팀의 핵심 진전은 그물망을 더 많은 아크릴아미드로 아주 미세하게 짜는 것을 유리하게 하는 화학적 결합을 분사하는 방법을 재구성하는 것이었습니다.
그래서 단백질이 그물체와 물리적으로 얽히게 되는 것이지요.
그것은 형광 항체 라벨에 의해 단백질에 부착된 귀중한 상피들을 더 개방적으로 만들었다.
윤 교수는 “우리가 발견한 것 중 하나는 포름알데히드가 존재하던 관류 단계에서 강력한 조직 확장을 위해 포름알데히드(MAP)가 존재할 때 하이드로겔 성분이 도입될 필요가 없었다는 것”이라고 말했다.
박 교수는 또 “MAP 용액을 첨가하기 전에 포름알데히드를 제거함으로써 단백질과 하이드로겔 망사이의 화학적 교차 연동을 막을 수 있을 것”이라며 “항체가 조직 내부 깊숙이 확산되도록 하면서 생체분자를 영구적으로 고정시킬 수 있는 최적의 상태를 찾을 수 있을 것”이라고 설명했다.
실험에서 그들은 시냅스 단백질 중 51개의 항체 라벨 중 49개는 이제 eMAP로 부착할 수 있는 반면 35개는 MAP로 부착할 수 있다는 것을 발견했다.
시냅스 보기
확장된 조직에서 이러한 새로운 라벨링 기능을 갖는 신경과학적 가치를 탐구하기 위해, 연구팀은 다른 포유류 시냅스를 연구하는 두 개의 BCS 연구소와 협력했다 – 엘리 네디비, 윌리엄 R.
(1964) & 린다 R.
젊은 신경과학 교수, 구오핑펑(1963년), 제임스 W.
(1963년), 패트리샤 T.
포이트라스 교수님.
이 합작품들은 바순이나 피콜로와 같이 이전에 배제되었던 단백질이나 호머1과 같이 이전에 거의 모습을 드러내지 않았던 단백질들을 증폭시킬 필요 없이 활기찬 이미지를 만들어냈다.
그 이미지들은 단백질이 시냅스 안에 어떻게 배열되어 있는지 정확히 보여주었고, 서로간의 상대적 거리, 그리고 상대적 풍요를 측정할 수 있었다.
eMAP는 또한 연구자들이 각각의 은유적인 시냅스 집 안을 쉽게 볼 수 있을 뿐만 아니라 전체 세포의 주변 지역까지 확대하기 쉽다는 것을 의미하는 Dendrite를 따라 시냅스의 멀티스케일 영상촬영도 허용했다.
네디비 교수는 시냅스가 살아있는 동물의 뇌에서 어떻게 변화하는지 연구한 결과 일반적으로 고해상도 방법으로 영상을 검증해야 하는 저해상도 범위를 사용하기 때문에 연구자들에게 큰 발전이라고 말했다.
전통적으로 그것은 전자현미경으로 행해져 왔다.
피카워 연구소와 MIT 생물학과 BCS의 네디비는 “전자파(EM)는 노동집약적이고 라벨링과 잘 결합되지 않기 때문에 차라리 사용하지 않겠다”면서 “광훈의 방법은 같은 종류의 해상도를 얻기는 하지만 셀당 훨씬 더 큰 표본 크기를 이미지화할 수 있는 기회를 제공한다”고 말했다.
게다가, 이 기술은 같은 조직의 항체 라벨링을 여러 번 허용하기 때문에, 과학자들은 같은 시냅스 내에서 많은 단백질에 라벨을 붙일 수 있다.
네디비와 펑의 연구소와 함께, 정 교수팀은 시냅스 양쪽에 있는 구조물에 시냅스를 가로질러 6개의 다른 단백질을 배열하는 방법을 보여주면서, 시냅스를 통해 시냅스 양쪽에 있는 구조물에 그것들이 어떻게 배열되어 있는지 보여주었다.
네디비와 정씨의 연구실에서도 억제 시냅스에 신경전달물질 GABA 수용체 성분(뉴런의 전기 신호 생성 가능성을 줄이기 때문에 그렇게 부른다)을 표시함으로써 서로 다른지 여부를 검사할 수 있다는 것을 보여주었다.
실제로, 그들은 절반 이상의 억제 시냅스가 그들이 찾던 두 요소를 모두 가지고 있지만, 1/4은 둘 다 가지고 있지 않고, 일부는 하나 또는 다른 것만을 가지고 있다는 것을 발견했다.
저자들은 “이러한 발견은 억제 시냅스가 분자 함량에서 균질하지 않음을 확인하고 eMAP가 시냅스 프로테오메의 정량적 조사를 위한 강력한 도구라는 것을 보여준다”고 썼다.
이 논문의 추가 저자는 김태윤, 캐서린 빌라, 이지헨, 장창, 박주혁이다.
JPB재단, 엔씨소프트문화재단, 국립보건원은 이 연구를 위한 기금을 제공했다.
